Pustaka Ilmiah Universitas Padjadjaran

Abstrak

Konstruksi Vektor Ekspresi Rekombinan Yang Mengandung Protein Faktor Sekresi Pichia pastoris dan Kloning Dalam Escherichia coli

Protein faktor sekresi Pichia pastoris (Sec4p) merupakan salah satu protein yang berperan untuk menargetkan protein-protein yang disekresikan ke luar sel. Sec4p sangat diperlukan pada inang ekspresi Pichia pastoris untuk menjamin bahwa semua protein rekombinan yang dirancang untuk ekspresi ekstraselular dikeluarkan dari sel. Overekspresi gen SEC4 dalam suatu inang ekspresi dapat meningkatkan sekresi protein rekombinan. Penelitian ini berhasil mengkonstruksi suatu vektor ekspresi rekombinan yang mengandung gen SEC4 dan mengkloningnya dalam Escherichia coli. Gen SEC4 diamplifikasi dari genom P. pastoris menggunakan metode PCR. Fragmen SEC4 dengan ukuran 615 pb diligasi ke vektor pJET1.2 menghasilkan plasmid rekombinan pJET1.2-SEC4 dan disubkloning dalam E. coli TOP10F’. Gen SEC4 dari plasmid pJET1.2-SEC4 yang telah dikarakterisasi, dipotong menggunakan enzim restriksi EcoR1. Fragmen SEC4 hasil pemotongan dengan enzim EcoR1 diligasi ke vektor pPIC3.5K menghasilkan vektor ekspresi rekombinan pPIC3.5K-SEC4 dan selanjutnya dikloning dalam E. coli TOP10F’. Hasil analisis restriksi dan penentuan urutan nukleotida gen SEC4 dalam plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil kloning menunjukkan bahwa vektor ekspresi yang mengandung gen SEC4 berhasil dikonstruksi dan gen SEC4 dengan ukuran 615 pb memiliki urutan nukleotida yang identik dengan urutan SEC4 P. pastoris di Genbank. Vektor ekspresi yang dihasilkan selanjutnya dapat diintroduksi ke dalam suatu inang P. pastoris, untuk menghasilkan sel inang yang dapat mensekresikan protein rekombinan dengan tingkat produksi tinggi.