Abstrak RSS

PENGARUH KO-EKSPRESI SEC4P PICHIA PASTORIS TERHADAP TINGKAT SEKRESI Α-AMILASE SACCHAROMYCOPSIS FIBULIGERA OLEH PICHIA PASTORIS

PENGARUH KO-EKSPRESI SEC4P PICHIA PASTORIS TERHADAP TINGKAT SEKRESI Α-AMILASE SACCHAROMYCOPSIS FIBULIGERA OLEH PICHIA PASTORIS
Shabarni Gaffar, Yeni W. Hartati
-
Indonesia
-

Produksi α-amilase rekombinan oleh sistem ekspresi P. pastoris dapat dimanfaatkan untuk berbagai industri. Enzim α-amilase dibutuhkan oleh industri pangan, tekstil, farmasi dan bioetanol. Inang ekspresi yang dapat mensekresikan protein keluar sel lebih disukai karena memudahkan proses pemurnian. Protein yang akan disekresikan ke luar sel akan melalui suatu jalur sekresi protein yang melibatkan banyak protein dan kompartemen di dalam sel. Sec4p merupakan suatu protein Rab yang berperan penting dalam tahap akhir sekresi protein. Protein ini berfungsi untuk menargetkan vesikel sekresi yang membawa protein yang akan disekresikan ke membran plasma pada proses pasca-Golgi untuk kemudian mengalami penggabungan dengan membran plasma dan mensekresikan protein yang dikandungnya ke luar sel. Ko-ekspresi Sec4p dalam suatu inang ekspresi ragi diketahui dapat meningkatkan tingkat sekresi protein asing.
Penelitian ini bermaksud untuk mempelajari pengaruh ko-ekspresi protein Sec4p P. pastoris terhadap tingkat sekresi α-amilase S. fibuligera oleh P. pastoris. Pada penelitian pendahuluan yang telah dilakukan, gen SEC4 yang berukuran 615 pb telah diamplifikasi dari genom P. pastoris dengan metoda PCR dan di subkloning menggunakan vektor pJET1.2 dalam inang E. coli.
Pada penelitian ini fragmen SEC4 hasil subkloning telah ditentukan urutan nukleotidanya dengan metoda Dye terminator. Selanjutnya fragmen SEC4 di kloning mengggunakan vektor ekspresi pPIC3.5K untuk P. pastoris menghasilkan plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4. Plasmid pPIC3.5K-SEC4 dikarakterisasi melalui pemotongan dengan enzim restriksi dan penentuan urutan nukleotida. Plasmid pPIC3.5K-SEC4 selanjutnya digunakan untuk mentransformasi P. pastoris rekombinan yang telah mengandung gen pengode α-amilase (ALP1) S. fibuligera.
Inang P. pastoris [ALP1/SEC4] digunakan untuk mempelajari pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap tingkat sekresi α-amilase oleh P. pastoris rekombinan. α-Amilase hasil ekspresi dianalisis aktivitasnya dan ditentukan kadar proteinnya, serta dibandingkan dengan hasil ekspresi tanpa ko-ekspresi Sec4p. Ko-ekspresi Sec4p diharapkan meningkatkan level sekresi α-amilase oleh P. pastoris. Inang P. pastoris yang mensekresikan α-amilase level tinggi dapat digunakan untuk produksi enzim -amilase yang dapat diaplikasikan untuk berbagai industri, seperti industri pangan, farmasi, tekstil dan detergen. Hasil penelitian yang telah diperoleh dan dilaporkan pada laporan ini adalah: Gen SEC4 berhasil diamplifikasi dari genom P. pastoris menggunakan metode PCR. Fragmen SEC4 dengan ukuran ~615 pb diligasi ke vektor pJET1.2 menghasilkan plasmid rekombinan pJET1.2-SEC4 dan disubkloning dalam E. coli TOP10F’. Gen SEC4 dari plasmid pJET1.2-SEC4 yang telah dikarakterisasi, dipotong menggunakan enzim restriksi EcoR1. Fragmen SEC4 hasil pemotongan dengan enzim EcoR1 diligasi ke vektor pPIC3.5K menghasilkan vektor ekspresi rekombinan pPIC3.5K-SEC4 dan selanjutnya dikloning dalam E. coli TOP10F’. Hasil analisis restriksi dan penentuan urutan nukleotida gen SEC4 dalam plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil kloning menunjukkan bahwa vektor ekspresi yang mengandung gen SEC4 berhasil dikonstruksi dan gen SEC4 dengan ukuran 615 pb memiliki urutan nukleotida yang identik dengan urutan SEC4 P. pastoris di Genbank. .
Selanjutnya gen SEC4 telah berhasil diintroduksi ke dalam P. pastoris [ALP1] sehingga diperoleh P. pastoris [ALP1-SEC4]. Hasil analisis aktivitas -amilase pada supernatan P. pastoris [ALP1-SEC4] menunjukkan ko-ekspresi Sec4p meningkatkan level sekresi α-amilase 2x lipat dibanding tanpa ko-ekspresi. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh waktu induksi yang paling optimum adalah 72 jam, dengan aktivitas spesifik 36, 91 U/mg.

Download: Full Teks