Pustaka Ilmiah Universitas Padjadjaran

Abstrak

Ekspresi Prethrombin-2 Manusia Recombinan Dalampichia Pastoris Dan Optimasi Kondisi Ekspresinya

Pretrombin merupakan prekursor dari trombin yang memiliki aktivitas proteolitik. Trombin merubah fibrinogen menjadi benang fibrin yang salah satu aplikasinya adalah dapat digunakan sebagai lem untuk menggantikan teknik jahitan pasca bedah. Aplikasi trombin untuk pembuatan lem fibrin menuntut diproduksinya trombin rekombinan. Tujuan dari penelitian ini adalah ekspresi gen pretrombin-2 (PT2) manusia rekombinan menggunakan sistem ekspresi Pichia pastoris. Gen pengode PT2 dirancang sesuai dengan kodon preferensi P. pastoris. Fragmen PT2 diamplifikasi dengan metoda PCR dengan penambahan sisi restriksi EcoR1 pada ujung 5’ dan sisi restriksi SacII pada ujung 3’. Produk PCR yang berukuran 924 pb diligasi dengan vektor ekspresi pPICZaB untuk P. pastoris dan disubkloning dalam inang Escherichia coli. Urutan nukleotida dikonfirmasi dengan metoda dideoxy Sanger. Plasmid rekombinan pPICZaBPT2 kemudian digunakan untuk mentransformasi P.pastoris SMD1168 defisien protease dengan metoda elektroporasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen PT2 berhasil diamplifikasi dan dikloning dalam E.coli. Analisis restriksi dan penentuan urutan DNA menunjukkan bahwa PT2 rekombinan 100% homologi dengan hasil rancangan. Hasil ekspresi PT2 oleh P. pastoris menggunakan metanol sebagai inducer memperlihatkan bahwa PT2 dengan berat molekul 35 kDa berhasil diekspresikan. Optimasi kondisi ekspresi melalui variasi konsentrasi metanol sebagai inducer dan sorbitol sebagai sumber karbon tambahan menunjukkan bahwa metanol 2% dan sorbitol 2% merupakan kondisi optimum ekspresi PT2.

Prethrombin is precursor of thrombin that has the proteolysis activity. Thrombin with fibrinogen will form fibrin threads that one of the application is can be used as a glue to substitute post-operative suture technique. The application of thrombin for making of fibrin glue needs the production of recombinant thrombin. The purpose of this study was to express the prethrombin-2 (PT2) gene in Pichia pastoris expression system. The synthetic PT2 was constructed to has optimized codon according to codon preference of P. pastoris. PT2 fragment was amplified by PCR method with the addition of EcoRI site at 5 ‘ end and SacII site at 3’ end. The 924 bp of PCR product was subclonned in Escherichia coli, then was ligated into pPICZaB expression vector and cloned in E. coli. The nucleotide sequences were confirmed by Sanger dideoxy sequencing method. The pPICZaB-PT2 recombinant plasmid then was used to transform protease deficient P. pastoris SMD1168 by electrophoration method. The results showed that PT2 gene has been successfully amplified and cloned in E. coli. Restriction analysis and DNA sequence determination showed that the sequence of PT2 recombinant has 100% homology with the design. Expression of PT2 by P. pastoris by using methanol as inducer showed that 35 kDa of PT2 was successfully expressed in P. pastoris. Optimazion of expression condition shows that 2% inducer concentration and addition of 2% sorbitol as additional carbon source were the optimum condition for PT2 expression.