Pustaka Ilmiah Universitas Padjadjaran

Abstrak

HAKI Buku Hasil Penelitian Pengembangan Produksi Trombin Rekombinan Sebagai Komponen Lem Fibrin Pengganti Jahitan Pada Bedah Mata : Kajian Desain Dan Ekspresi Gen Pada Escherichia Coli

Penelitian berjangka waktu tiga tahun ini bertujuan untuk menghasilkan teknologi produksi trombin manusia rekombinan yang secara teknoekonomi memadai, selanjutnya produk trombin dapat digunakan dalam lem fibrin otologus yang aman dan nyaman. Pada tahun pertama dan kedua maka protokol produksi pretrombin-2 (PT2) manusia telah berhasil dioptimasi, menggunakan: (i) kodon PT2 untuk gen sintetik yang sesuai E. coli dan P. pastoris; (ii) pTWIN1 yang memiliki promoter T7 dan sistem pemurnian intein; (iii) inang yang memiliki chaperon yang dapat bekerja pada suhu rendah. Protokol tersebut telah menghasilkan ekspresi PT2 dalam bentuk protein fusi terlarut di E. coli galur BL21(DE3) ArcticExpress. Selanjutnya, optimasi ekspresi pada E. coli BL21(DE3) ArcticExpress untuk meningkatkan kelarutan protein fusi telah dicapai menggunakan konsentrasi IPTG 0,1 mM, suhu inkubasi 12i o C. Pemurnian PT2 yang dimediasi intein menghasilkan pita 27 dan 35 kDa yang masing-masing menunjukkan intein dan PT2. Pada sistem P. pastoris telah berhasil dilakukan transformasi plasmid pPICZa yang membawa gen pretrombin-2 dan optimasi ekspresi pada P. pastoris galur GS115 dan SMD1168 yang defisien protease.Tujuan penelitian pada tahun ketiga adalah melakukan uji aktivitas trombin sebagai protease serin dan sebagai pembentuk bekuan fibrin pada jaringan mata hewan yang sudah disayat, peningkatan skala produksi, dan aplikasi trombin sebagai komponen lem fibrin pada hewan percobaan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa (i) Trombin rekombinan baik yang dihasilkan oleh Escherichia coli (struktur tanpa glikosilasi) maupun Pichia pastoris (struktur terglikosilasi) keduanya aktif dan mampu berfungsi sebagai komponen lem fibrin. (ii) Ekspresi protein fusi CBD-Intein-PT2 telah berhasil dilakukan dalam bentuk terlarut oleh E. coli BL21(DE3) ArcticExpress maupun dalam bentuk badan inklusi oleh E. Coli BL21(DE3). Walaupun jumlah mg protein fusi dalam bentuk badan inklusi oleh E. coli BL21(DE3) jauh lebih besar dibandingkan protein fusi terlarut oleh E.coli BL21(DE3) ArcticExpress, pemurnian lebih lanjut menggunakan sistem intein untuk protein terlarut lebih efektif dibandingkan sistem pelarutan badan inklusi diikuti renaturasinya. (iii). Ekspresi protein PT2 oleh P. pastoris SMD1168 yang defisien protease telah menghasilkan protein rekombinan PT2 terlarut dalam jumlah mg, jauh lebih besar dibandingkan kedua galur E. coli. Optimasi metode pemurnian lebih lanjut sedang dikembangkan. (iv). Kultivasi sel dengan densitas tinggi galur unggul E. coli BL21(DE3) ArcticExpress yang mengemban protein fusi CBD-Intein-PT2 telah dilakukan. Selanjutnya kajian tekno-ekonominya menunjukkan bahwa untuk menghasilkan 1 unit trombin rekombinan (tanpa memasukan harga ekarin) dibutuhkan biaya Rp. 574, masih lebih murah dibandingkan trombin manusia standar (Sigma) seharga Rp. 26000 per unit.