Pustaka Ilmiah Universitas Padjadjaran

Abstrak

Peningkatan Sekresi Á-amilase Melalui Manipulasi Peptida Sinyal Dan Efisiensi Pelipatan Protein Dalam Pichia Pastoris

Enzim á-amilase bekerja menghidrolisis ikatan á-1,4-glikosidik dalam pati untuk menghasilkan maltosa dan oligosakarida berbagai ukuran. Enzim á-amilase banyak digunakan dalam berbagai industri, dengan demikian pengembangan produksi á-amilase perlu dilakukan. Salah satu teknologi produksi enzim adalah dengan memproduksinya dalam sistem ekspresi protein heterolog. Sistem ekspresi Pichia pastoris banyak digunakan untuk memproduksi protein heterolog karena tingkat ekspresinya yang tinggi, mudah dilakukan untuk peningkatan skala produksi, adanya modifikasi pasca translasi, serta mampu mensekresikan protein heterolog dengan ukuran lebih besar dari 50 kDa. Namun level sekresi pada beberapa protein rekombinan tertentu masih rendah. Penelitian ini dilakukan dengan hipotesis bahwa peningkatan efisiensi translokasi dan peningkatan efisiensi pelipatan protein dalam retikulum endoplasma akan meningkatkan jumlah sekresi á-amilase S. fibuligera pada sistem ekspresi P. pastoris. Peningkatan efisiensi translokasi dilakukan melalui penggantian peptida sinyal á-amilase dengan peptida sinyal á-mating factor (AMF) S. cerevisiae ditambah 15 residu asam amino yang serupa dengan peptida sinyal á-amilase saliva mencit. Peningkatan efisiensi pelipatan protein dilakukan dengan penambahan ekspresi gen pengkode faktor pelipatan protein, yaitu protein disulfida isomerase (PDI1). Penelitian ini akan dilaksanakan selama tiga tahun. Pada tahun pertama ini telah dilakukan penggantian peptida sinyal á-amilase S. fibuligera melalui metoda PCR; konstruksi vektor ekspresi untuk Pichia pastoris yang mengandung gen á-amilase S. Fibuligera yang peptida sinyalnya sudah diganti; dan sekuensing gen á-amilase yang peptida sinyalnya sudah diganti. Pada tahun kedua akan dilakukan transformasi P. pastoris dengan vektor ekspresi rekombinan; seleksi transforman yang menghasilkan á-amilase paling tinggi; serta analisis aktifitas á-amilase intraselular dan ekstraselular. Pada tahun ketiga akan dilakukan konstruksi vektor ekspresi untuk P. pastoris yang mengandung gen PDI1; transformasi P. pastoris rekombinan yang dihasilkan pada tahun kedua dengan vektor ekspresi-PDI1; analisis aktifitas á-amilase intraselular dan ekstraselular; pemurnian dan karakterisasi á-amilase. Kombinasi rekayasa peptida sinyal á-amilase dengan ko-ekspresi gen PDI1 ini, diharapkan dapat meningkatkan jumlah sekresi á-amilase secara signifikan. Pada penelitian tahun pertama telah berhasil dirancang primer 5’MSPáF dan 3’ALPIApa untuk memodifikasi peptida sinyal dan mengamplifikasi gen ALP1 S. fibuligera yang akan disisipkan ke dalam plasmid ekspresi pPICZA. Amplifikasi peptida sinyal termodifikasi-gen ALP1 S. fibuligera (MSALPI) dengan teknik PCR menggunakan pasangan primer 5’MSPáF dan 3’ALPIApa telah menghasilkan fragmen berukuran 1,7 kb. Selanjutnya gen MSALPI telah berhasil disubklon dalam vektor pGemT menghasilkan plasmid rekombinan pGemT-MSALPI, dan ditentukan urutan nukleotidanya. Hasil penentuan urutan nukleotida terhadap plasmid rekombinan pGemT-MSALPI menunjukkan bahwa peptida sinyal gen ALPI telah berhasil dimodifikasi. Selain itu, pada hasil penentuan urutan nukleotida juga ditemukan tiga mutasi pada gen ALPI hasil kloning, namun berdasarkan hasil analisis translasi DNA ternyata mutasi ini merupakan silent mutation, sehingga tidak merubah urutan asam amino á-amilase. Selanjutnya gen MSALPI telah berhasil diklon dalam vektor ekspresi pPICZA untuk P. pastoris dan menghasilkan plasmid rekombinan pPICZA-MSALPI. Hasil karakterisasi terhadap plasmid rekombinan, menunjukkan bahwa pPICZA-MSALPI telah berhasil dikonstruksi.